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分光光度计

分光光度计

分光光度计（Spectrophotometer），是利用物质对光的选择吸收现象，进行物质定性和定量分析的仪器。主要由光源、单色器、样品室及吸收池、检测系统和显示系统组成。光源产生的复合光，通过单色器被分解为单色光。当单色光通过样品时，一部分被吸收，其余未被吸收的光到达检测系统转变为电信号，经放大和数据处理后，通过显示系统使人们得到测量的结果。

1665年，艾萨克·牛顿（Isaac Newton）使用三棱镜分解太阳光；1760年，朗伯（J.H.Lambert）提出朗伯定律，指出物质对光的吸收与物质的厚度成正比；1815年，约瑟夫·冯·夫琅和费（J.Fraunhofer）发现了太阳光谱中的夫琅和费线；1852年，比耳（A.Beer）提出比耳定律，指出物质对光的吸收与物质的浓度成正比。朗伯定律和比耳定律的结合构成了朗伯-比耳定律，为分光光度法的发展提供了理论基础。20世纪初，美国科学家阿诺德·奥尔德福·贝克曼（Arnold J. Beckman）等人发明了第一台商业化分光光度计，并于1940年推出了D型（DU型）分光光度计。自20世纪70年代起，分光光度计开始实现自动化和数字化。随着技术和材料的不断更新，分光光度计的类型也在不断迭新，以满足不同领域和不同应用的需求。

在科研领域中，分光光度计常用于物质鉴定、反应动力学研究和化合物组成及稳定常数的测定等方面。在食品检验领域，分光光度计通过对食品中的复合型防腐剂、复合型鲜味剂等成分的分析完成对食品成分的定性与定量检测。在环境监测中，分光光度计可被用于废水中苯酚的浓度测定和大气污染监测中的臭氧含量观测，通过定量测定的方法为环境保护提供数据支撑。在造纸工业领域，分光光度计被广泛应用于单组份有色物定量分析、多组分混合物分析以及木质素测定。在医药产业中，分光光度计可用于药物规格检验、中药品质鉴定、杂质控制、反应监测以及添加剂质量检测，以确保所生产的药物质量符合标准。

发展历史

早期理论探索（17世纪至19世纪初）

1665年，英国科学家艾萨克·牛顿（Isaac Newton）首次使用三棱镜将太阳光分解成红、橙、黄、绿、蓝、、紫的色带，证明了太阳光是复合光。

1760年，朗伯（J.H.Lambert）发现物质对光的吸收与物质的厚度成正比，即光透过物质时，其强度随着物质厚度的增加而指数递减，被称为朗伯定律。

1815年，约瑟夫·冯·夫琅和费（J.Fraunhofer）发现太阳光谱中有600多条暗线，并且对主要的8条暗线标以A、B、C、D、E、F、G、H符号。这些暗线被称为“夫琅和费线”（Fraunhofer 谱线）。

1852年，比耳（A.Beer）在又发现物质对光的吸收与物质的浓度成正比，被称为比耳定律。人们把朗伯定律和比耳定律结合起来，称之为朗伯-比耳定律，简称比耳定律。朗伯-比耳定律提供了一种更全面的描述物质对光的吸收的方法，成为了分光光度法的理论基础，为分析化学领域的发展做出了重要贡献。

第一台分光光度计的诞生（20世纪初）

1940年，美国国家技术实验室的阿诺德·奥尔德福·贝克曼（Arnold J. Beckman）等人发明了第一台商业化分光光度计。

最初的分光光度计因存在性能问题而进行了多个型号的改进。 B型分光光度计使用石英棱镜代替玻璃棱镜，提高了设备的紫外线能力。 C型分光光度计提高了UV中的波长分辨率。 D型（又称为DU型）分光光度计采用氢灯和其他改进技术生产，并一直保持该设计至1976年停产。

相比与之前的化学分析方法，DU分光光度计分析耗时短至数分钟，且准确度高达99%。诺贝尔化学奖得主布鲁斯·梅里菲尔德（Bruce Merrifield）曾评价分光光度计“可能是有史以来为推动生物科学发展而开发的最重要的仪器”。

技术进步和应用拓展（20世纪中期起）

20世纪60年代，双光束的分光光度计问世，进一步提高了分析的精度和效率。

20世纪70年代，随着微型计算机的引入，分光光度计开始实现自动化和数字化，提高了数据处理速度和准确度。微型计算机的应用使得分光光度计的性能更加优越，功能得到了进一步扩大，应用范围更加广泛。

自20世纪70年代起，在技术和材料的不断更新下，分光光度计的种类、型式、结构也在不断地更新和改进。根据使用的波长范围、单色器和检测器类型、光路的差异、进样系统的不同以及读数系统的多样性，科学家设计出多种多样的分光光度计以满足不同领域和不同应用的需求。

理论基础和工作原理

电磁辐射

20世纪初，马克斯·普朗克（Max Planck）提出了量子论，说明光既是粒子又是一种电磁波，并提出光量子（光子）能量与电磁辐射的频率有关，表达式为：

式中，为辐射的光子能量（单位：）；为普朗克常数（）；为辐射的频率（单位：）；为光速（）；为波长（单位：）。该式将粒子说的光子能量与波动说的辐射频率（波长）联系到一起，用于计算各种频率或波长光子的能量。

原子或分子中的电子，总是处在某一种运动状态之中。每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。这些电子由于各种原因，如光、热、电等的激发，放出光或放出热，而从一个能级转移到另一个能级，称之为跃迁。当这些电子吸收了外来辐射的能量后，就会从能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。因此，每一跃迁都对应着吸收一定的能量（一定波长）的辐射。谱线的频率（）或波长（）与跃迁前后两个能级的能量差之间的关系服从马克斯·普朗克条件，即：

物质呈现特定颜色的原因是它们选择性地吸收了可见光中特定波长的光线。物质只会选择性地吸收那些能量等于分子振动、转动和电子运动能量总和的辐射。由于物质分子的能级不同，它们对光的吸收程度也不同。因此，物质对光的选择性吸收反映了其分子内部结构的差异，即不同物质的内部结构决定了它们对不同光线的吸收程度。因此，研究物质的吸收光谱可以提供关于其内部结构的重要信息。

朗伯-比耳定律

朗伯-比耳定律（Lambert-Beer），简称比耳定律，数学表达式为：

式中，为光程；为溶液的浓度；为吸光系数（单位：）。

式中，若将浓度用摩尔浓度表示，光程用厘米表示，则吸光系数为摩尔吸光系数（单位：），一般用表示。表达式可改写为：

朗伯-比耳定律可以描述为：当一束平行的单色光通过某一均匀的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的乘积成正比。朗伯-比耳定律是光度分析中定量分析的最基础、最根本的依据。

工作原理

物质对光的吸收和物质的内部结构有关，通过对物质吸收光谱的测定、比较，可以进行定性或定量的分析。分光光度计通单色器分出不同波长的光作为入射光，使不同波长的光分别通过待测样品，对每一波长的入射光透过样品后可以测得吸收度。以波长为横坐标，与波长相对应的吸收度为纵坐标作图，就得到样品的吸收曲线，也称为吸收光谱。整个吸收光谱的形状取决于样品的性质、结构，所以可作为物质定性分析的根据。同时，只要选择一定波长的光测定样品的吸收度，由朗伯-比耳定律即可求出样品的浓度和物质的含量。

基本结构

无论分光光度计的型号、类别怎样，操作方式如何，是比较原始的手动仪器，还是自动化程度很高全部由微型计算机控制的最新式仪器，通常它们都由光源、单色器、样品室、检测器、显示系统五个部分构成，其结构方框图如下图所示。

光源

光源即辐射源，是指能发射所需波长范围的辐射的发光体。光源需要在广泛的光谱范围内提供连续的辐射光谱，覆盖需要测量的整个光谱范围，以便测量不同波长处的吸收光谱。光源需要具有足够的辐射强度，以激发样品中的分子从基态到激发态的跃迁，产生足够的吸收光谱信号，以便能够被检测器检测到。光源必须具有良好的稳定性，确保其辐射强度在一定时间内保持不变。这是为了确保测量结果的准确性和可重复性。光源的辐射能量在所需波长范围内应该尽可能保持稳定，以减小因波长变化而引起的测量误差。

用于分光光度计的光源有多种，常见的光源有：

单色器

单色器又称为波长选择器，能够从辐射源辐射出的复合光中选择分离出一定波长范围的单色光，并能随意改变波长。单色器将复合光分散成单色光，并通过调节色散元件的角度来选择特定波长的单色光。单色器通常由以下五个主要部分组成：

样品室及吸收池

样品室是专供放置各种类型不同、光程不同、形状各异的吸收池及相应的池架附件的小室。样品室的内侧面包括室盖内表面都必须完全是黑色的，样品室内的吸收池支架也应该是黑色的，室盖必须十分严密且不漏光，以避免外部光线的干扰和不必要的反射。样品室通常可拆卸，并配备不同类型的吸收池，以适应不同类型和尺寸的样品。根据不同的应用需求，样品室可以是普通型或大型型。大型样品室通常用于测量固体样品或在光学测量时直接测定样品的透射和反射。

吸收池是用来盛放样品的容器，确保样品受到光的均匀照射，从而实现光谱分析。吸收池的材料必须在使用的波长范围内不吸收光辐射，通常选择光学玻璃、透明聚合物、高纯二氧化硅、氟化钙或氟化锂等材料。吸收池的内部必须光洁无划痕，平面度和平行度要符合规定范围，以保证测量的准确性。在同一组实验中所采用的吸收池需要有较好的配对性，以提高测量的精确度。常见的吸收池类型包括矩形池、圆型池、流动池、微型池、双光路吸收池等。

检测系统

检测系统由检测器和信号放大两部分组成。检测器是将化学或物理变化转换为电信号的装置，其质量直接影响到仪器的性能和测量结果的准确性。常用的检测器类型有光电池、光电池、光电倍增管、光电二极管矩阵。

显示系统

显示系统又称读出系统，将检测器输出的电信号转换为易于记录和指示的物理量，以供操作人员使用。显示系统对检测器输出的电信号进行处理，通常包括放大、滤波和数字化等过程，以确保信号质量的可靠性和准确性。将电信号转换为易于记录和指示的物理量，例如光吸收度、光强度或发光强度等，以便实现对样品性质的定量或定性分析。

显示系统配备了各种类型的显示装置，包括检流计、微安表、数字电压表、数字显示表头、打印机、计算机控制的记录仪以及彩色或黑白图像显示仪等。简易型仪器通常使用检流计或微安表作为显示装置，适用于基本的光谱测量和定性分析。具有数字化功能的显示表头能够直观地显示测量结果，并提供数字化输出，方便记录和数据处理。配备打印机的分光光度计能够将测量结果直接输出到纸张上，便于保存和报告。计算机控制的记录仪能够实现自动扫描功能，并通过计算机软件实现数据处理和分析，提高测量的效率和精度。彩色或黑白图像显示仪能够以图形方式显示测量结果，直观地展示样品的光谱特征，便于分析和比较。

使用方法

试样制备

气体试样

对气体试样进行分光光度测定时，可以将气体试样直接注入气体试样池中。对易挥发的液态试样也可用气体试样池。只要往气体试样池中滴入几滴试样，待其挥发成蒸气并且充满整个气体试样池后即可进行测定。

液体试样

在制备溶液试样时最重要的是溶剂的选择问题。对分光光度分析用的溶剂的主要求当然是能使试样充分溶解，在测定波长范围内尽可能透明，含有尽可能少的干扰吸收峰，除此以外还应十分注意溶剂和溶质之间不能有明显的相互作用，避免因产生“溶剂效应”而使比耳定律失效或造成试样吸收峰变化。

固体试样

对于那些无定形或粉末状的固体试样，如果不能找到合适的溶剂制备成溶液试样，或者为了避免溶剂影响，或者为了研究固体状态下的某些现象的本质，就必须保持试样的固态形式即制备成固体试样进行分光光度测定。制备固体试样有两类方法：设法获得薄片或薄膜状试样；把粉末状试样分散到适当的介质中并赋以一定的形状。

仪器预准备

每次使用仪器前，必须预先通电一段时间，使仪器的电子系统进入稳定工作状态后才能进行测定(对电子管系统的仪器尤为重要，预热时间应在半小时左右或更长些，否则会有明显的测定结果漂移现象)。开机时应先开主机电源，后开光源电源。主机开机后应注意防止光电倍增管直接受到强光照射。

放入测定试样前，应先仔细调零，检查和调节基线的平直性，注意记录器运动是否灵活正常，听听有否异常噪声，扫描过程中光源、滤光片、光栅等关键零件有否运转及切换不正常情况。确信一切正常后方可进行测定。

上机测样

按照试样测试要求确定工作波段、设定仪器扫描范围。实测时，为了避免扫描机构中的机械空回、间隙等因素造成的波长误差或其他随机误差，一般应从离待测吸收峰较远的波长处启动，然后单方向进行扫描记录。

测试时应根据测定要求和试样特性正确选择仪器的工作参数，应特别注意狭缝宽度、扫描速度、响应速度、电子系统的增益等。狭缝宽度直接影响到测定时的光谐分辨率和仪器的测定灵敏度。若需高分辨率测定，则应使缝宽窄、增益高（但增益太高时噪声也会相应增加）、扫描速度慢；反之，如不要求高分辨率测定，则可把狭缝开大些、扫描快些，以节省测定时间。

一般分光光度计的测量步骤可按如下进行：

注意事项

使用分光光度计时应注意保护仪器及其附件。各种操作钮、开关只能轻缓旋转或扳动，切忌碰撞或用劲硬拧。仪器中的各种精密光学零件工作表面、光源和接收器工作面都不能直接用手触摸。在测试液体试样或挥发性物质时应注意防止试样及溶剂洒落在仪器上或残留在试样室中，以免腐蚀仪器。每次测试完毕，应使仪器返回扫描起始端、把各种操作钮转回安全位置（如电流最小、电压最低、响应最慢、狭缝宽度最小等等）。如要安装或换用不同附件，应先仔细阅读仪器使用说明书，按照正确的方法和步骤拆卸或安装。但要注意安装基面及凸台、销钉、凹槽等定位、限位件位置是否正确，检查附件中的光学零件表面是否沾污或有发毛、发乌、膜层脱落等现象。如发现问题必须及时处理或修复。

应用

科研领域

物质的鉴定

物质的吸收光谱与物质的属性之间的对应关系是很严格的，有明显的特征性。因此分光光度计可以根据每种物质在紫外-可见-红外区的吸收光谱的特征谱线或谱带，明确地判断组成此物质的元素、化学键类别、包含的功能基团等，从而判认出该物质的类别，达到鉴定物质的目的。

结构分析

物质光谱中的吸收峰的位置和强度除了与组成此物质的分子、原子种类、数量和化学键有关外，而且也与其化学结构或立体结构有关，即与构成此物质分子的原子的空间排列几何构型有关。因此两种化合物即使其化学组成相同，只要它们的物质结构不同，它们的吸收光谱（主要是红外吸收光谱）就不会一样。因而，可以通过分光光度计来判识或确定物质结构、识别各种同分异构体(例如链异构、位异构、顺反异构、多品异构等)。

纯度检验

分光光度计可以鉴定化合物的纯度，主要方法是对比已有化合物与纯的化合物的吸收图谱，如果产生特殊的吸收杂峰即可判断化合物中含有杂质。

反应动力学研究

分光光度计通过吸收光谱的测定可以判断反应过程的进程，从而得出一些化学反应速度常数，并从两个及以上温度条件下得到的速度数据，得出反应活化能。

络合物组成及稳定常数的测定

络合物是金属离子与有机化合物进行配位产生的化合物，一般由中心原子和围绕它的分子或者离子通过配位键形成，其在紫外可见区域具有一定的吸收性质。分光光度计通过对其进行紫外可见吸收的测定，可以推断出该络合物的组成成分及稳定常数。

对所测定的物质进行定量

通过准备不同浓度的标准样品并在一定波长下测出吸光度值，结合公式，（为吸光度值；为吸光系数；为比色皿厚度；为溶液浓度）绘制吸收光谱曲线并拟合为线性方程，通过分光光度计测定未知浓度的样品吸光度，代人方程可以得到该溶液浓度。

食品检测

在进行食品的加工与制作的过程中，为了确保具有颜色的饮料产品保持相同的颜色，能够在可见光区采用紫外可见分光光度计展开对其吸光度值的有效测定，令色差能够达到食品生产的具体要求。

紫外可见分光光度计还能够用于对食品的安全检测。由于不同的物质具有不同的吸收光谱曲线，通过物质吸收光谱中特殊波长的峰值、波形变化，紫外可见分光光度计可以检测食品中的物质含量。例如，可以运用紫外线分光光度法检测食品中的复合型防腐剂、复合型鲜味剂等，较好地排除食品中不应当使用的添加剂。

环保监测

紫外可见分光光度计可以在将待测污染物样品进行粉碎处理的前提下，滴入碱性提取液，采用浸出提取的方式，使浸出液中的Cr6+与酸性环境中的二苯碳酰二肼发生化学反应，产生紫色配位化合物，然后再在波长540nm处进行分光光度法测定，同时采用外标法进行数据定量分析，从而获取精准的检测数据和结果，使之成为环境监测保护的数据支撑。

对于废水中的微量苯酚，可以用紫外可见分光光度计在苯酚的最大吸收峰为 269.3 nm 左右的波长下，测定不同浓度的苯酚标准样品的吸光度，绘制相关曲线并计算苯酚在中性溶液中的表观摩尔吸光系数为1524.58 L/摩尔，然后再通过定量测定的方式，测定并计算废水中苯酚的吸光度，获悉废水中苯酚的浓度为39 mg/L。

在大气污染监测中，主要的污染物包括二氧化硫、二氧化氮以及可吸入颗粒等，这些指标含量的多少会在一定程度上影响到区域空气污染情况，所以上述指标就成为空气污染监测重点。使用紫外可见分光光度计可以通过监测大气中的臭氧含量的方式，观察并监测数据，以此判定和分析大气层的状态，获取大气层是否被破坏的数据资料，为大气污染处理和整治提供数据基础。

造纸工业

紫外可见分光光度计可用于造纸工业中的单组份有色物的定量分析，多组分混合的分析以及纸浆中木质素的测定。生产过程中，蒸煮器的喷放线上可作蒸煮终点控制，浆料洗涤的最后阶段可作洗涤效率测量，对浆料的卡伯价进行检测来达到控制浆料质量和节约能量的目的。

医药领域

红外分光光度计可以对药物的规格进行检验。对于中药材来说，由于其为天然产物，成分比较复杂，也可将其红外光谱与已知中药比对，鉴定中药品质。为了控制药品的质量，红外光谱除用来鉴别药物的主要成分外，有时也可用来验证杂质成分是否为已知物并控制杂质的限度、或用于分析某些与药物有关的物质。在药物合成反应的过程中，通过对中间体的红外光谱分析，能够及时了解反应的情况，便于掌握反应下一步的顺利进行。在生产药物的进程中，一般会使同一批药物的颜色相同，可以用紫外可见分光光度计测定其吸光光度值，符合相应的药物标准，保证药物质量合格。化学药物中经常添加一些可使用的添加剂，降低成本和提高药物效果，可以用紫外分光光度计检测添加剂的质量并进行分析。根据不同特征基团在特定光波处的光谱特征，可以对含有氧核糖核酸或蛋白质等生物大分子的药物进行检测。

维护与保养

为了保证分光光度计具有良好的准确性可靠性和较长的使用寿命，必须使仪器处于良好的工作环境之中，同样也必须经常地、仔细地对仪器加强维护与保养。

仪器的工作环境：应安放在室温变化不大，不受阳光直射的房间内，并应放置在平稳的工作台上。使环境的湿度保持在70%以下，并注意防尘、防震、防电磁干扰及防腐。

仪器使用者在使用仪器前应先详细阅读仪器的使用说明书，并了解仪器各键盘的作用与功能。

定期检查仪器左部干燥筒内的防潮变色硅胶，如发现硅胶颜色变红，应及时调换。

定期检查仪器波长的准确性，以免引起不必要的测量误差。

每次测量液体样品后应检查样品溶液是否残留在样品室内，如有残留液，则应及时擦干净，以免污染样品室。

仪器使用完毕后，用随机提供的防尘套罩住，在套子内应放数袋硅胶，以免光源灯室受潮，影响仪器的性能。

参考资料

..2024-05-21

..2024-04-12

..2024-05-02