致突变试验

致突变试验是一种用于检测化学致突变物的方法，主要用于筛查潜在的致癌物质。这种试验是人类预防癌症的重要手段之一，其中以细菌致突变试验的应用最为普遍。

基因突变试验

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

又被称为Ames试验，该试验旨在检测受试物能否促使鼠伤寒沙门氏菌组氨酸的生物合成营养缺陷型突变株(his-)恢复为野生型(his+)。试验菌株均为组氨酸突变(his-)类型，无法自主合成组氨酸，在缺乏组氨酸的最低营养平板上无法生存。一旦回复突变为野生型，即可自我合成组氨酸并在最低营养平板上形成可见菌落。通过计算最低营养平板上的回变菌落数目，来确定受试物是否存在致突变性。标准试验菌株包括TA97、TA98、TA100和TA102，其中TA97和TA98检测移码突变，TA100检测碱基置换突变，TA102对醛、过氧化物及脱氧核糖核酸交联剂比较敏感。这些菌株不仅包含his-突变，还有其他附加突变，以增强其敏感性。

试验分为点试验（预试验）和掺入试验（标准试验）。掺入试验中，受试物的最高剂量为5mg/皿或出现毒性及沉降的剂量，至少设置五个剂量点，并设有阴性（溶剂）对照和阳性对照。将受试物、试验菌株培养物和S9混合液添加到顶层培养基中，均匀涂抹在最低营养平板上，置于37℃环境中培养48小时，随后计数可见菌落数。阳性的判断标准是，如果每皿回变菌落数为阴性对照的每皿回变菌落数的两倍以上，并且呈现出剂量-反应关系，那么就认为该受试物是鼠伤寒沙门氏菌的致突变物。

S9混合液是由多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆9000Xg上清液（S9）与NADP及葡萄糖-6-磷酸等辅助因子组成的代谢活化系统。如果不添加S9混合液获得阳性结果，说明受试物是直接致突变物；只有在添加S9混合液的情况下才获得阳性结果，说明该受试物是间接致突变物。只要在一个试验菌株中获得阳性结果，就认为受试物是致突变物；只有当所有四种试验菌株均获得阴性结果，才认为受试物是非致突变物。

哺乳动物细胞基因突变试验

哺乳动物体外培养细胞的基因正向突变试验通常使用的小鼠淋巴瘤L5178Y细胞、中国地鼠肺V79细胞和卵巢CHO细胞的三个基因位点突变，分别是次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）、胸苷激酶（TK）和Na+/K+ATP酶（OUA）位点。HGRPT和Na+/K+ATP酶位点突变可用于上述三种细胞，OUA位点突变仅适用于CHO细胞。HGRPT和TK可分别使6-硫代鸟嘌呤（6-TG）转移上磷酸核糖及使5-溴脱氧尿苷磷酰化，它们的代谢产物可掺入脱氧核糖核酸导致细胞死亡。因此，正常细胞在含有这些碱基类似物的培养基中无法生长，但在致突变物的作用下，这两个位点发生突变的细胞对抗这些碱基类似物具有抗药性，能够增殖形成克隆。

染色体畸变试验

染色体分析

染色体分析是观察染色体形态结构和数量变化的一种方法，国外常称为细胞遗传学检验。这种方法可以通过显微镜观察细胞染色体的变化。对于结构畸变，常见的现象包括裂隙、断裂、断片、微小体、染色体环、粉碎、双或多着丝粒染色体和射体。对于缺失，除染色单体缺失外，还需要进行核型分析。对于相互易位，除配子非同源性染色体相互易位外，倒位、插入、重复等都需要显带染色才能发现。对于数目畸变，需要在染毒后经历一次有丝分裂才能被发现。然而，经过一次有丝分裂后，一些结构畸变可能会因遗传物质的丢失而导致细胞死亡，因此无法被发现。因此，应该安排多个收获时间，以便分别检查断裂剂的作用。收获时间的安排还应考虑到外来化合物可能在细胞周期的不同时间段产生作用，以及延长细胞周期的影响。

体细胞的染色体分析可以在体内或体外进行。体内试验通常观察骨髓细胞，而体外试验常用的是中国地鼠肺细胞（CHL），以及中国仓鼠卵细胞（CHO）和V79等细胞系。然而，任何细胞系的染色体都不稳定，难以准确观察非整倍体。因此，在体外试验中，如果要考虑进行染色体数量观察，应该使用原代或早期细胞，例如人外周淋巴细胞。体内试验与人体的实际接触情况相似，但需要注意的是，受试物或其活性代谢产物可能不容易在骨髓中达到足够的浓度。体外试验由于受试物与细胞直接接触，因此常常比体内试验更灵敏。

微核试验

微核试验是检测染色体无着丝点断片或因纺锤体受损而丢失的整个染色体在细胞分裂后期留下的子细胞胞质内的次级核。常用啮齿动物骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核试验。PCE是红细胞成熟过程中的一个阶段，此时红细胞的主要核已经排出，微核易于辨识。PCE胞质富含核糖核酸染色，与成熟的红细胞易于区分，因此是骨髓微核试验的理想细胞群体。常用小鼠进行试验，至少设置两个处理组，最高剂量为LD50/7的80%（LD50/7是在7天内使一半动物死亡的剂量），另一个组为LD50/7的40%，可通过灌胃或腹腔注射给予受试物，同时设置阴性和阳性对照组，每组至少8只动物，雌雄各半。给毒方案有多样选择，比如连续四天，每天一次。第五天处死动物，收集骨髓，制作涂片，固定并染色。每只老鼠计数1,000个PCE的微核出现率。当经过适当的统计学分析，处理组微核率明显高于阴性对照组，并显示出剂量-反应关系时，就可以认为受试物对该试验动物的骨髓细胞产生了致染色体损伤的作用。

DNA损伤试验

姐妹染色单体交换（SCE）试验

SCE是染色体同源位置上DNA复制产物的互换，SCE可能与DNA的断裂和重组相关，暗示DNA损伤。SCE试验可分为体外试验、体内试验和体内、体外结合试验。体外SCE试验可以使用贴壁生长的细胞，如CHO、V79、CHL等，也可以使用悬浮生长的细胞，如人外周血淋巴细胞。细胞在含有5-溴脱氧尿苷（BrdU）的培养液中生长两个周期。由于BrdU是嘧啶类似物，能够在合成期内掺入脱氧核糖核酸互补链，因此在下一个中期相中，每个染色体的姐妹染色单体之间都会有一条互补链掺入BrdU，使得姐妹染色单体的染色没有区别。但是到了第二个周期的中期相，每个染色体中只有一条染色单体保留了原来的不带BrdU的模板链，而另一条染色单体则是上一个周期带BrdU的互补链成为模板链。因此，经过两个周期的BrdU掺入互补链可以使两姐妹染色单体所含BrdU量不同，从而出现染色差异。如果BrdU仅在第一个周期掺入，第二个周期不掺入，则第二个中期相中可以看到姐妹染色单体染色有差异。如果脱氧核糖核酸单链发生了断裂，并且在修复过程中发生了重排，就会在第二个周期看到姐妹染色单体同位节段的相互交换。经过差别染色后，可以观察到两条颜色不同的染色单体。如果两条染色单体之间发生了等位交换，可以根据每条染色单体内出现深浅不同的染色片段进行识别和计数。

程序外DNA合成试验

程序外DNA合成试验的基本方法是测量S期之外3H-胸苷掺入胞核的量，这个掺入量反映了DNA损伤后修复合成的数量。由于这种合成发生在脱氧核糖核酸正常复制合成的主要时期之外，因此被称为程序外DNA合成（unschedule DNA synthesis UDS）试验或DNA修复合成试验。一般使用人淋巴细胞或啮齿动物肝细胞等不处于正在增殖状态的细胞较为方便，否则就需要人工将细胞阻断在G1期，使其增殖同步化。然后在药物的抑制下，使残留的半保留DNA复制降至最低限度，这样才能避免掺入水平极高的半保留复制对掺入水平极低的程序外DNA合成的观察。

参考资料

致突变试验的概念.百度文库.2024-11-07

鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验.百度文库.2024-11-07

遗传性疾病检验技术-姐妹染色单体互换检验.百度文库.2024-11-07